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以下为正文:

色谱积分方法,最近几年控制的比较严格,部分规定任何的积分方法修改都要经过批准。而手动积分又是实验室经常面临的问题,所以,何时可以手动积分?如何进行手动积分?这些一直以来都是色谱分析工作者最头疼的问题,今天就和大家一起啃掉这块“硬骨头”。


定义



1

积分


指在信号中确定峰并计算其大小,积分包括以下操作及步骤:识别、校正、定量。


2

积分事件的参数控制


对于某个信号进行积分时,软件将识别每个峰的开始和结束时间,并用竖线标记这些点,寻找每个峰的峰顶点,确定保留时间/迁移时间,建立基线,以及计算每个峰的峰面积、峰高和峰宽。这些过程积分事件的参数控制。


3

自动积分


自动积分功能为设置初始事件提供开始点。自动积分功能设置以下参数:初始斜率灵敏度(阈值)、初始峰高、初始峰宽、初始最小峰面积


4

手动积分


此类型的积分允许对选定的峰或峰组进行积分,在指定的手动积分范围内,将忽略此软件的事件积分(初始最小峰面积除外)。如果手动积分出来的一个或多个峰低于最小峰面积阈值,则此积分将被废弃。手动积分时间使用绝对时间值。它们不会为信号漂移作调整。


在报告中,手动积分提供以下功能:

§ 划基线:指定为一个峰或一组峰划基线的位置;

§ 负峰:指定何时将基线以下的面积当作负峰处理;

§ 切线撇去:计算从主峰切线撇去的峰面积;

§ 分裂峰:指定用垂线分裂峰的点;

§删除峰:从积分结果中删除一个或多个峰。



积分参数



自动积分主要是修改以下4个积分参数实现的,具体如下:


1

斜率灵敏度(Slope Sensitivity)


也称阈值,指设置信号斜率的值,该斜率用于识别积分过程中峰的起点和终点。如何信号斜率大于“斜率灵敏度”值,将建立峰起点,如果信号斜率降到“斜率灵敏度”以下,将建立峰止点。


设置值越低,峰响应越灵敏,当然,不同品牌的仪器对设置值的响应程度会有所区别。


2

峰宽值(Peak Width)


用于控制积分器的选择性以区分峰与基线噪音。如果设置的初始峰宽太小,则可能将噪音当作峰。如果宽峰与窄峰混在一起,可以选用运行时间编程事件设定特定的峰宽。


3

最小峰面积值(Area Reject)


根据峰面积来设置小于目标峰面积的峰将不被积分也不会报告;


4

最小峰高(Height Reject)


最小目标峰的高度,任何小于最小峰高的峰将不被积分及报告。



何时进行手动积分


1.低分离度或低响应;


2.流动相不稳定,基线紊乱,保留时间变化小; 


3.运行过程中,出现异常峰; 


4.软件积分的局限性,如由于软件参数阈值的设置导致峰未积分,峰起点和终点间出现肩峰和异常的基线漂移,软件错误;


5.由于样品母体的干扰导致的复杂色谱图,裂峰、目标杂质的同时洗脱/肩峰、基线噪音、负峰、基线上升或下降、峰的严重拖尾、烃类的存在导致自动积分不正确。



积分原则



1

关于手动积分


能进行手动积分吗?答案是肯定的,可以进行手动积分,但手动积分必须在受控的情况下进行。一般情况下,应采用自动积分方式,不可以手动积分。特殊情况下,若是目标峰实在无法自动积分的,即对于采取高级积分的方式还不能将峰有效的积分,经申请与批准后,可以进行手动积分。


此外必须严格控制手动积分次数,因为如果一套好的分析方法,峰与峰之间分离较好,根本是不需要手动积分,如果需要手动积分的图谱,分析方法必定不好。


2

关于忽略限


单个杂质及总杂质的定量测定,选择合适的阈值设置和合适的条件进行积分是很重要的。这种情况下,峰值可忽略通常设为0.05%。因此,数据采集系统的阈值设置至少相当于这个限制的一半(0.025%)。对任何未与主峰完全分离的杂质进行积分,最好采用峰谷对峰谷外推法(切向撇去法)。”


3

关于积分方法是否需要固定


积分方法是否需要固定?个人认为应该分情况,分析方法验证期间时积分参数摸索期,通过整套分析方法验证过程来确定积分参数,这期间没有修改积分参数之说,因为本身就没有积分方法。放行检测的积分方法可以先根据验证情况进行确定,之后所有检测的积分方法应该是固定,任何修改积分参数的行为应该进行申请,批准后方可修改。


稳定性考察为了反映杂质的趋势,积分方法可以与放行方法不同,但不同时间点的积分方法应该相同,任何修改,同样需要申请及批准。


4

积分方法的审计追踪


目前的色谱系统,均有审计追踪,当我们对积分方法进行修改时,均会出现“comment”,要求输入具体的修改内容。



手动积分的方法及演算



1.色谱软件使用动态寻峰算法和自动寻峰算法。


2.通常建议先用软件积分色谱来处理像峰宽、阈值、峰高及峰面积等需要积分的情形。


3.因为一些固有的或分析变化以及基线漂移的原因,自动积分将会有偏差,从而进行手动积分。


图 6.3.7-1表示标准品和某浓度下的样品通过同样的积分事件进行积分,并一同呈现在同一色谱图中。对小峰、接近峰、负峰、漂移峰以及峰谷进行积分需要时间和技巧。不推荐手动积分,且应尽可能避免进行手动积分。


图 6.3.7-2 是一个模型色谱图,它同时展现了手动积分峰和软件积分峰。


打印出的色谱图应以可见比例形式呈现各个分析项需要的内容,如对于含量和单个分析项,峰顶应可见;对于纯度分析,峰基应可见。

图 6.3.7-3以一个有着适当比例和可见的色图谱来说明适当的积分。行业内通常的做法是为多组分分析提供清晰可见的基线,而为单峰分析提供整个色谱峰。


图 6.3.7-4a是一张以最大比例打印的色谱图,其中峰值积分并不可见。Figure 6.3.7-4b是同样的色谱图以适当的比例打印,其中可以看到峰值修正和缺失峰的积分,揭示了手动积分操作。



含量溶出度以及含量均一性包含了对单一分析物/峰按照已知标准进行计算的分析项目。在这些类型的分析项目中,都期望其具有准确和精确的系统适应性特征的高斯峰。正常的高斯峰应该确切地从色谱峰起始位置开始积分到截止为止结束积分。图 6.3.7-5a-5f 展现了这些类型测试代表性的峰积分。


图 6.3.7-5a是单组分分析的未处理的信号峰。图 6.3.7-5b表示的是对原始数据以适当的积分事件进行积分并以可见的比例呈现。图 6.3.7-5c 表示的是通过修整积分而产生了低面积的峰。图 6.3.7-5d表示的是对原始数据用不适当的积分事件进行积分会表达更多的面积。


在这些图示中,所有的积分都是通过调整色谱软件的积分事件来完成的。色谱软件会标示出哪些峰是手动积分的。实验室应该有适当的控制措施以检测应用了错误的积分事件而造成的数据损毁。


Figure 6.7.7-6a-6c 和Figure 6.7.7-7a-7c展示的是成分分析/色谱纯度分析这种多组分分析(峰组)中的发生的积分错误。这两种情况下,报告的峰面积都会减少。



手动积分注意事项



1.手动积分不能试图通过以下动作来使数据符合标准要求:减少峰(减少峰面积)、增加峰(增加峰面积)、改变峰高;

 

2.同一次检验的所有标准品、对照品、样品等必须使用同一方法进行手动积分;

 

3.手动积分结束后,应打印自动积分图谱和手动积分图谱附于手动积分申请表之后,提交QC经理审核;

 

3.自动积分的图谱不得删除或被覆盖,应与手动积分图谱保存于计算机中,打印的自动积分图谱和手动积分图谱应标识清楚签名,随同手动积分申请表附于检验原始记录后面一起交质量管理部经理、QP审核无问题后归档。

 

4.研发和生物实验室可能需要手动积分。尽管对于QC实验室,手动积分可能仅在特殊情况下是必需的或可接受的;但手动积分还是不适合应用于分析检测实验室。手动积分只有在得到主管书面批准且结果正确记录后,根据批准程序才能进行,而不应该由分析师自行决定。


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